بررسی اثر مهار واریانت Oct4B1 بر پروفایل بیانی ژن‌های کنترل کننده مسیرهای سلولی مرگ برنامه ریزی شده

جزئیات و دریافت

دانلود پروژه بررسی  اثر مهار واریانت Oct4B1 بر پروفایل بیانی ژن‌های کنترل کننده مسیرهای سلولی مرگ برنامه ریزی شده

این فایل با فرمت word قابل ویرایش، آماده پرینت و ارائه به عنوان پروژه پایانی می باشد

فهرست مطالب

فصل اول: کلیات و مروری  بر مطالعات گذشته

1-1. تاريخچه

1-2. سلول‌های بنيادي

1-3. سلول بنیادی سرطان (Cancer Stem Cell)

1-4. مکانیسم‌های مولکولی خود بازآفريني در سلول‌های بنيادي

1-5. ژن OCT4

1-6. مسیر مرگ برنامه‌ریزی‌شده (Apoptosis Pathways)

1-7. استرس(Stress)

1-8. طراحي تحقيق و اهميت آن

فصل دوم: مواد و روش‌ها

2-1. تهيه رده‌های سلولي

2-2. استخراج RNA تام سلولي

2-3. بررسي كمي و كيفي RNA استخراج شده

2-3-1. بررسي جذب نوري با دستگاه اسپكتروفتومتر

2-3-2. الكتروفورز در ژل آگارز

2-3-2-1. روش تهيه محلول‌ها و بافرهاي مورد نياز در الكتروفورز

2-3-2-1-1. محلول EDTA (pH=8 و0.5M)      

2-3-2-1-2. تهيه بافر TBE 5X

2-3-2-2. عکس‌برداری از ژل آگارز

2-4. واكنش رونويسي معكوس

2-5. واكنش PCR

2-5-1. طراحي پرايمرها

2-5-1-1. آماده‌سازی پرايمرها

2-5-2. واكنش PCR

2-5-3. واكنش Real-Time

2-5-3-1. انجام واكنش Real-Time PCR

2-5-3-2. تعيين Efficiency هر جفت پرايمر

2-6. سركوب بيان ژن از طريق استراتژي siRNA

2-6-1. طراحي اليگو نوكلئوتيدهاي siRNA

2-6-2. آماده‌سازی سلول‌ها جهت انجام ترانسفكشن siRNAها

2-6-2. تهيه سوسپانسيون و انجام  ترانسفكشن siRNAها

2-7. بررسي ميزان زنده ماندن سلول‌ها پس از ترانسفكشن با انجام تست MTT

2-7-1. روش تهيه محلول رنگ MTT

2-7-1-1.  آماده‌سازی سلول‌ها و انجام تست MTT

2-7-2. آناليز ميزان جذب نوري در طول موج 570 نانومتر با كمك دستگاه اسپكتروفتومت

2-8. بررسي ميزان رخداد آپوپتوزيس با روش Annexin-V FLOUS

2-8-1. آماده‌سازی محلول‌های رنگ كيت

2-9. تعيين پروفايل بياني ژن‌های کنترل‌کننده مسير آپوپتوزيس

2-10. تعيين پروفايل بياني ژن‌های کنترل‌کننده مسير استرس

فصل سوم: نتايج و یافته‌ها

3-1. توصيف رده‌های سلولي

3-2. تعيين كميت و كيفيت RNA استخراج شده

3-3. بهینه‌سازی شرايط واكنش Real-Time qPCR

3-4. تعيين پروفايل بياني واريانت هاي OCT4

3-4-1. پروفايل بياني واريانت هاي OCT4 در رده‌های سلولي مورد مطالعه

3-5. انجام مهار OCT4B1 با تكنولوژي siRNA

3-5-. تأیید مهار واريانت OCT4B1 در سلول‌های گروه آزمايش

3-6-. تأثیر مهار واريانت OCT4B1 بر ميزان زنده ماندن سلول‌ها(viability)

3-7. مهار OCT4B1 باعث افزايش ميزان آپوپتوزيس می‌شود

3-8-. PCR Array

3-8-1. انجام PCR Array و آناليز نتايج

3-8-2. ژن‌های مورد بررسي در مسير سلولي مرگ برنامه‌ریزی‌شده

3-8-3-1. پروفايل بياني ژن‌های TNF Ligand Family

3-8-3-2. پروفايل بياني ژن‌های  TNF Receptor Family

3-8-3-3. پروفايل بياني ژن‌های Bcl-2 Family

3-8-3-4. پروفايل بياني ژن‌های Caspase Family

3-8-3-5. پروفايل بياني ژن‌های IAP Family

3-8-3-6. پروفايل بياني ژن‌های TRAF Family

3-8-3-7. پروفايل بياني ژن‌های CARD Family

3-8-3-8. پروفايل بياني ژن‌های Death Domain Family

3-8-3-9. پروفايل بياني ژن‌های Death Effector Domain Family

3-8-3-10. پروفايل بياني ژن‌های CIDE Domain Family

3-8-3-11. پروفايل بياني ژن‌های p53 and DNA Damage Response

3-8-3-12. پروفايل بياني ژن‌های Anti-Apoptosis

3-9. ژن‌های مورد بررسي در مسير سلولي استرس (پروتئین‌های شوك حرارتي و چاپرون ها)

3-9-1. الگوي بياني ژن‌های مسير استرس (پروتئین‌های شوك حرارتي و چاپرون ها)

3-9-1-1. پروفايل بياني ژن‌های  HSP90 Family Members

3-9-1-2. پروفايل بياني ژن‌های  HSP70 Family Members

3-9-1-3. پروفايل بياني ژن‌های  HSP40 Family Members

3-9-1-4. مقايسه پروفايل بياني ژن‌های  HSP60 Family Members

3-9-1-5. پروفايل بياني ژن‌های  Small HSPs

3-9-1-6. پروفايل بياني ژن‌های  Other Regulators of Protein Folding

فصل چهارم: بحث، نتیجه‌گیری و پیشنهادها

4-1. اهميت تحقيق و اهداف آن

4-2. بررسي بيان واریانت‌های OCT4 در رده‌های سلول سرطاني مورد مطالعه

4-3. نقش OCT4B1 در دو مسير مهم سلولي آپوپتوزيس و استرس سلولي

4-4. ارتباط مهار واريانت OCT4B1 با ميزان زنده ماندن (viability) سلول‌ها

4-5. مهار OCT4B1 باعث افزايش ميزان آپوپتوزيس می‌شود

4-6. بررسي پروفايل بياني ژن‌های کنترل‌کننده مسير آپوپتوزيس به دنبال سركوب بيان واريانت OCT4B1 در رده‌های سلول سرطاني مورد مطالعه

4-7. بررسي پروفايل بياني ژن‌های مؤثر در مسير استرس به دنبال سركوب بيان واريانت OCT4B1 در رده‌های سلول سرطاني مورد مطالعه

4-8. نتیجه‌گیری نهایی

4-9. پیشنهادات

4-10. پیوست‌ها

فهرست منابع و مأخذ

چکیده انگلیسی

فهرست شکل‌ها:

شکل ‏2 1: جايگاه پرايمرها روي توالی‌های واريانت هاي OCT4

شکل ‏2 2: منحني استاندارد مورد استفاده در تعيين Efficiency واكنش

شکل ‏2 3: تصوير شماتيك يك پليت PCR Array

شکل ‏3 1: تصوير الكتروفورز نمونه Total RNA استخراج شده از سه رده سلولي مورد مطالعه

شکل ‏3 2: ميزان بيان واريانت هاي OCT4 در رده‌های سلول سرطاني مورد مطالعه. محور افقي: سه رده سلول سرطاني شامل AGS(آدنوكارسينوم معده)، 5637 (تومور مثانه) و U87MG ( تومور بدخيم مغز). محور عمودي: ميزان بيان هر واريانت (َA:OCT4A ، B: OCT4B و B1: OCT4B1) نسبت به ژن بتا اكتين (ژن خانگي به‌عنوان كنترل داخلي). تصوير به خوبي نشان می‌دهد كه هر سه واريانت A، B و B1 در رده‌های سلولي به كار رفته بيان می‌شوند.

شکل ‏3 3: ميزان بيان واريانت OCT4B1 در رده سلولي AGS، 24، 48 و 72 ساعت پس از ترانسفكشن siRNA. محور افقي: دو گروه تست (ترانسفكت شده با OCT4B1 siRNA) و گروه كنترل (ترانسفكت شده با scramble siRNA) رده سلولي  AGS(آدنوكارسينوم معده). محور عمودي: ميزان بيان واريانت OCT4B1 در مقايسه با بتا اكتين (ژن خانگي به‌عنوان كنترل داخلي) پس از گذشت 24، 48 و 72 ساعت از ترانسفكشن سلولي

شکل ‏3 4: نتايج تست MTT در رده سلولي AGS. نتايج نشان می‌دهد ميزان زنده ماندن سلول‌های ترانسفكت شده با OCT4B1-siRNA در مقايسه با سلول‌های ترانسفكت شده با scramble siRNA كمتر است و اين كاهش زنده ماندن با گذشت زمان بيشتر می‌شود.

شکل ‏3 5: نتايج تست فلوسايتومتري ميزان رخداد اپوپتوزيس در رده سلولي  AGS، 48 ساعت پس از ترانسفكشن. Test (سلول‌های ترانسفكت شده با OCT4B1 siRNA)، Control (سلول‌های ترانسفكت شده با scramble siRNA). سلول‌های قرار گرفته در مربع پايين سمت راست، نشان‌دهنده سلول‌های اپوپتوتيك می‌باشند. از كيت Annexin-V-FLOUS جهت تعيين درصد سلول‌های آپوپتوتيك استاده شده است.رنگ آنكسين (Annexin-V-FLOUS)، متصل به FITC است كه توسط شناساگر FL1 رديابي می‌شود و رنگ پروپيديوم آيوديد (PI) توسط شناساگر FL3 شناسايي می‌شود.

شکل ‏3 6: نمونه‌ای از نتايج منحني واكنش (سمت چپ) و منحني ذوب (سمت راست) تست PCR Array

شکل ‏3 7: نمودار تغييرات بيان ژني خانواده TNF ligands، در سه رده سلولي AGS، 5637 و U87MG، پس از مهار واريانت OCT4B1      Error! Bookmark not defined.

شکل ‏3 8: نمودار تغييرات بيان ژني خانواده TNF receptors، در سه رده سلولي AGS، 5637 و U87MG، پس از مهار واريانت OCT4B1

شکل ‏3 9: نمودار تغييرات بيان ژني خانواده BCL2 (1)، در سه رده سلولي AGS، 5637 و U87MG، پس از مهار واريانت OCT4B1

شکل ‏3 10: نمودار تغييرات بيان ژني خانواده BCL2 (2)، در سه رده سلولي AGS، 5637 و U87MG، پس از مهار واريانت OCT4B1    Error! Bookmark not defined.

شکل ‏3 11: نمودار تغييرات بيان ژني خانواده Caspase، در سه رده سلولي AGS، 5637 و U87MG، پس از مهار واريانت OCT4B1

شکل ‏3 12: نمودار تغييرات بيان ژني خانواده IAP، در سه رده سلولي AGS، 5637 و U87MG، پس از مهار واريانت OCT4B1

شکل ‏3 13: نمودار تغييرات بيان ژني خانواده TRAF، در سه رده سلولي AGS، 5637 و U87MG، پس از مهار واريانت OCT4B1

شکل ‏3 14: نمودار تغييرات بيان ژني خانواده CARD، در سه رده سلولي AGS، 5637 و U87MG، پس از مهار واريانت OCT4B1

شکل ‏3 15: نمودار تغييرات بيان ژني خانواده Dath Domain، در سه رده سلولي AGS، 5637 و U87MG، پس از مهار واريانت OCT4B1

شکل ‏3 16: نمودار تغييرات بيان ژني خانواده Dath Effector، در سه رده سلولي AGS، 5637 و U87MG، پس از مهار واريانت OCT4B1

شکل ‏3 17: نمودار تغييرات بيان ژني خانواده CIDE، در سه رده سلولي AGS، 5637 و U87MG، پس از مهار واريانت OCT4B1

شکل ‏3 18: نمودار تغييرات بيان ژني خانواده P53 and DNA damage (1)، در سه رده سلولي AGS، 5637 و U87MG، پس از مهار واريانت OCT4B1

شکل ‏3 19: نمودار تغييرات بيان ژني خانواده P53 and DNA damage (2)، در سه رده سلولي AGS، 5637 و U87MG، پس از مهار واريانت OCT4B1  Error! Bookmark not defined.

شکل ‏3 20: نمودار تغييرات بيان ژني خانواده Anti-apoptosis (1)، در سه رده سلولي AGS، 5637 و U87MG، پس از مهار واريانت OCT4B1

شکل ‏3 21: نمودار تغييرات بيان ژني خانواده Anti-apoptosis (2)، در سه رده سلولي AGS، 5637 و U87MG، پس از مهار واريانت OCT4B1       Error! Bookmark not defined.

شکل ‏3 22: نمودار تغييرات بيان ژني خانواده HSP90، در سه رده سلولي AGS، 5637 و U87MG، پس از مهار واريانت OCT4B1    Error! Bookmark not defined.

شکل ‏3 23: نمودار تغييرات بيان ژني خانواده HSP70، در سه رده سلولي AGS، 5637 و U87MG، پس از مهار واريانت OCT4B1    Error! Bookmark not defined.

شکل ‏3 24: نمودار تغييرات بيان ژني خانواده HSP40 (1)، در سه رده سلولي AGS، 5637 و U87MG، پس از مهار واريانت OCT4B1

شکل ‏3 25: نمودار تغييرات بيان ژني خانواده HSP40 (2)، در سه رده سلولي AGS، 5637 و U87MG، پس از مهار واريانت OCT4B1    Error! Bookmark not defined.

شکل ‏3 26: نمودار تغييرات بيان ژني خانواده HSP40 (3)، در سه رده سلولي AGS، 5637 و U87MG، پس از مهار واريانت OCT4B1    Error! Bookmark not defined.

شکل ‏3 27: نمودار تغييرات بيان ژني خانواده HSP40 (4)، در سه رده سلولي AGS، 5637 و U87MG، پس از مهار واريانت OCT4B1    Error! Bookmark not defined.

شکل ‏3 28: نمودار تغييرات بيان ژني خانواده HSP60، در سه رده سلولي AGS، 5637 و U87MG، پس از مهار واريانت OCT4B1

شکل ‏3 29: نمودار تغييرات بيان ژني خانواده Small HSPs، در سه رده سلولي AGS، 5637 و U87MG، پس از مهار واريانت OCT4B1

شکل ‏3 30: نمودار تغييرات بيان ژني خانواده Other protein folding (1)، در سه رده سلولي AGS، 5637 و U87MG، پس از مهار واريانت OCT4B1

شکل ‏3 31: نمودار تغييرات بيان ژني خانواده Other protein folding (2)، در سه رده سلولي AGS، 5637 و U87MG، پس از مهار واريانت OCT4B1  Error! Bookmark not defined.

فهرست جداول:

جدول ‏2 1: توالي و مشخصات پرايمرها

جدول ‏3 1: مشخصات و ميزان بيان ژن‌های خانواده TNF ligands به دنبال مهار واريانت OCT4B1 در سه رده سلولي مورد مطالعه

جدول ‏3 2: مشخصات و ميزان بيان ژن‌های خانواده TNF receptor به دنبال مهار واريانت OCT4B1 در سه رده سلولي مورد مطالعه

جدول ‏3 3: مشخصات و ميزان بيان ژن‌های خانواده BCL2 به دنبال مهار واريانت OCT4B1 در سه رده سلولي مورد مطالعه

جدول ‏3 4: مشخصات و ميزان بيان ژن‌های خانواده Caspase به دنبال مهار واريانت OCT4B1 در سه رده سلولي مورد مطالعه

جدول ‏3 5: مشخصات و ميزان بيان ژن‌های خانواده IAP به دنبال مهار واريانت OCT4B1 در سه رده سلولي مورد مطالعه

جدول ‏3 6: مشخصات و ميزان بيان ژن‌های خانواده TRAF به دنبال مهار واريانت OCT4B1 در سه رده سلولي مورد مطالعه

جدول ‏3 7: مشخصات و ميزان بيان ژن‌های خانواده CARD به دنبال مهار واريانت OCT4B1 در سه رده سلولي مورد مطالعه

جدول ‏3 8: مشخصات و ميزان بيان ژن‌های خانواده Death Domain به دنبال مهار واريانت OCT4B1 در سه رده سلولي مورد مطالعه

جدول ‏3 9: مشخصات و ميزان بيان ژن‌های خانواده Death Effector به دنبال مهار واريانت OCT4B1 در سه رده سلولي مورد مطالعه

جدول ‏3 10: مشخصات و ميزان بيان ژن‌های خانواده CIDE به دنبال مهار واريانت OCT4B1 در سه رده سلولي مورد مطالعه

جدول ‏3 11: مشخصات و ميزان بيان ژن‌های خانواده p53 and DNA Damage Response به دنبال مهار واريانت OCT4B1 در سه رده سلولي مورد مطالعه

جدول ‏3 12: مشخصات و ميزان بيان ژن‌های خانواده Anti-Apoptosis به دنبال مهار واريانت OCT4B1 در سه رده سلولي مورد مطالعه

جدول ‏3 13: مشخصات و ميزان بيان ژن‌های خانواده HSP90 Family Members به دنبال مهار واريانت OCT4B1 در سه رده سلولي مورد مطالعه

جدول ‏3 14: مشخصات و ميزان بيان ژن‌های خانواده HSP70 Family Members به دنبال مهار واريانت OCT4B1 در سه رده سلولي مورد مطالعه

جدول ‏3 15: مشخصات و ميزان بيان ژن‌های خانواده HSP40 Family Members به دنبال مهار واريانت OCT4B1 در سه رده سلولي مورد مطالعه

جدول ‏3 16: مشخصات و ميزان بيان ژن‌های خانواده HSP60 Family Members به دنبال مهار واريانت OCT4B1 در سه رده سلولي مورد مطالعه

جدول ‏3 17: مشخصات و ميزان بيان ژن‌های خانواده Small HSPs به دنبال مهار واريانت OCT4B1 در سه رده سلولي مورد مطالعه

جدول ‏3 18: مشخصات و ميزان بيان ژن‌های خانواده Other Regulators of Protein Folding به دنبال مهار واريانت OCT4B1 در سه رده سلولي مورد مطالعه

جدول ‏4 1: ژن‌های کنترل‌کننده مسير آپوپتوزيس كه پس از مهار واريانت OCT4B1 كاهش بيان (Down-regulation) بيش از دو برابر (>2 folds) داشته‌اند

جدول ‏4 2: ژن‌های کنترل‌کننده مسير آپوپتوزيس كه پس از مهار واريانت OCT4B1 افزايش بيان (Up-regulation) بيش از دو برابر (>2 folds) داشته‌اند

جدول ‏4 3: ژن‌های کنترل‌کننده مسير استرس كه پس از مهار واريانت OCT4B1 كاهش بيان (Down-regulation) بيش از دو برابر (>2 folds) داشته‌اند

جدول ‏4 4: ژن‌های کنترل‌کننده مسير استرس كه پس از مهار واريانت OCT4B1 افزايش بيان (Up-regulation) بيش از دو برابر (>2 folds) داشته‌اند

فهرست تصاوير و جداول پيوست:

پيوست 1. درخت ژني تغييرات بيان 84 ژن مسير آپوپتوزيس در رده‌های سلولي مورد مطالعه

پيوست 2. بيان افتراقي ژن‌های مسير آپوپتوزيس در رده‌های سلولي مورد مطالعه

پيوست 3. درخت ژني تغييرات بيان 84 ژن مسير استرس سلولي در رده‌های سلولي مورد مطالعه

پيوست 4. بيان افتراقي ژن‌های مسير استرس سلولي (پروتئین‌های شوك حرارتي و چاپرون ها) در رده‌های سلولي مورد مطالعه

چکیده

سرطان يكي از بیماری‌های مهم انسان است كه در خصوص ماهيت ايجاد و گسترش آن و در نتيجه در خصوص درمان آن نيز اطلاعات كاملي وجود ندارد. بنابراين شناخت مکانیسم‌های شکل‌گیری سلول سرطاني بسيار حائز اهميت است.

در خصوص ايجاد سرطان در بافت‌های بدن انسان نظريات مختلفي مطرح است اما تئوري سلول بنيادي سرطان (Cancer stem cell)، جديدترين و بااهمیت‌ترین اين نظريات است. طبق اين نظريه، منشأ سرطان در بدن سلول‌هایی هستند كه قدرت بنيادي (Stem cell) دارند اين سلول‌ها می‌توانند سلول‌های بنيادي بافتي باشند يا سلول‌های سوماتيكي كه به علت تغييرات ژنتيكي خاصيت خودبازآفريني (Self-renewal) پيدا کره‌اند.

بر اين اساس، ژن‌هایی كه القاء كننده قدرت ناميرايي هستند مورد توجه قرار گرفتند كه يكي از مهم‌ترین اين ژن‌ها، OCT4 است.

اين ژن با فرايند پردازش افتراقي (Alternative splicing) حداقل سه واريانت مختلف را كد می‌کند (OCT4A، OCT4B و OCT4B1). اخیراً مشخص شده است واريانت OCT4B1 در سلول‌های سرطاني نسبت به ديگر واريانت هاي OCT4 بيان بالاتري داشته و قدرت سركوبگري مرگ برنامه‌ریزی‌شده سلول (آپوپتوزيس) دارد. همچنين نشان داده شده است اين واريانت به دنبال اعمال استرس سلولي (شوك حرارتي)، به همراه پروتئین‌های شوك حرارتي افزايش بيان پيدا می‌کند..