فایل بررسی برخی miRNA در رده سلولی مشتق از سرطان رتینوبلاستوما بیان کننده افزایشی TGIF2LX
دسته بندي :
کالاهای دیجیتال »
رشته پزشکی (آموزش_و_پژوهش)
این پایان نامه در قالب فرمت word قابل ویرایش ، آماده پرینت و ارائه به عنوان پروژه پایانی میباشد
زمينه و هدف: رتینوبلاستوما از تومورهای داخل چشمی شایع در کودکان می باشد. اگرچه در درمان رتینوبلاستوما پیشرفت وجود دارد ولی شکست در درمان و مرگ و میر در کشور های توسعه یافته چشم گیر می باشد. مهمترین علت این شکست مقاومت دارویی و عوارض آن می باشد.هدف این مطالعه ارزیابی اثر متقابل داروی SD-208 داروی ضد سرطان و افزایش بیان TGIF2LX در سلول های Y79 رده سلولی رتینوبلاستوما می باشد.
روش پژوهش: در اولین مرحله ارزیابی پروتئین TGIF2LX ،وکتور PEGFP-N1 که شامل تمام سکانس ژن TGIF2LXبود به سلول های Y79 ترانسفکت شد و بیان آن توسط میکروسکوپ UV و Realtime RT-PCR ثابت شد. همراه با ترانسفکشن سلول با دز های مختلف داروی SD-208 ( (0,1µM,2µMتیمار شد.سپس الگوی بیان 5miRNA شامل Let7g,18a,34a,22,20a در سلول های ترانسفکت شده تیمار شده و بدون تیمار در مقایسه با سلول های ترانسفکت نشده مورد بررسی قرارگرفت.
يافته‌ها:ما متوجه شدیم که تمام miRNA ها در سلول های ترانسفکت شده تیمار شده و با داروی SD-208 افزایش بیان داشتند p<0.05 بجز miRNA20a.
نتیجه گیری:این اولین مطالعه است که نشان داد که SD-208 بیان ژن هموباکس وmiRNA های متفاوت را افزایش می دهد که نقش تومورساپرسوری در رتینوبلاستوما را دارند.همچنین نتایج ما پیشنهاد می کند که استفاده همزمان TGIF2LXو SD-208 می تواند روش جدید در درمان رتینوبلاستوما باشد. فصل 1:مقدمه و بیان مسئله 1
1.1رتینوبلاستوما 2
1.1.1 اپیدمیولوژی 2
1.1.2 پاتوژنز 3
1.1.3 ویژگی های کلینیکی وتشخیصی 5
1.2 تاریخچه خانوادگی 5
1.3 تشخیص 5
1.4 ارزیابی قبل از درمان 6
1.5 درمان 6
1.6 مکانیسم مولکولی سرطان 9
1.6.1 مسیر پیام رسانی TGFβ 9
1.6.1.1 خانواده لیگاند های TGFβ 11
1.6.1.2 رسپتور نوع 1و2 ( TGFβRI,II) 11
1.6.1.3 فسفریلاسیون SMAD 12
1.6.2 تنظیم پیام رسانی TGFβ 12
1.6.3 دخالت پیام رسانیTGFβ در سرطان 13
1.6.4 ژنهای همئوباکس(Homeobox) 14
1.6.4.1 ساختار ژن های همئوباکس 14
1.7 نقش ژن های همئوباکس (Homeobox) در ایجاد سرطان 17
1.8 miRNA 18
1.8.1 بیوژنز miRNA ها و نحوه مهار ترجمه 19
1.9 miRNA و سرطان 20
1.10 miRNA ابزاری برای شناسایی و تشخیص سرطان 21
1.11 miRNA ودرمان سرطان 22
1.12 بیان مسئله و اهمیت پژوهش 23
1.13 اهداف پژوهش 24
1.13.1 هدف اصلی 24
1.13.2 اهداف ویژه 24
1.13.3 هدف کاربردی 25
فصل 2: بررسی متون 26
2.1 بررسی متون مرتبط با موضوع 27
فصل 3:مواد و روش ها 32
3.1 مواد شیمیایی و آنزیم ها 33
3.1.1 پلاسمیدوسویه باکتری 35 3.1.1.1 خصوصیات پلاسمید 36
3.1.1.2 خصوصیات میزبان 37
3.2 روش ها 37
3.2.1 کشت باکتری 37
3.2.1.1 مواد و وسایل مورد نیاز برای کشت باکتری 37
3.2.1.2 طرز تهیه محیط کشت LB مایع 38
3.2.1.3 گلیسرول استاک 38
3.2.2 روش انجام miniprepاستخراج DNA پلاسمیدی از باکتری 39
3.2.2.1 بررسی کمی وکیفی DNA پلاسمیدی 41
3.2.3 هضم آنزیمی پلاسمید های استخراج شده 45
3.2.4 کشت سلولی 46
3.2.4.1 محیط کشت 46
3.2.4.2 سرم جنینی گاوFBS 47
3.2.4.3 تهیه محیط انجاد از سلولها 47
3.2.4.4 خصوصیات سلولهای مورد استفاده شده در این پایان نامه 48
3.2.5 تعیین منحنی کشندگی انتی بیوتیک G418 48
3.2.6 منطبق سازی سلولها 48
3.2.7 ترانسفکشن سلولهای Y79 با وکتور پلاسمیدی نوترکیب pEGFP-TGIF2LX 49
3.2.8 انتخاب سلولهای مثبت 50
3.2.9 بررسی بیان ژن TGIF2LX در سلول های ترانسفکت شده در سطح mRNA بوسیله Realtime RT-PCR 51
3.2.9.1 محافظت از RNA 52
3.2.9.2 استخراج RNA 55
3.2.9.3 تیمار نمونه RNA باآنزیم دئوکسی ریبونوکلئاز I 59
3.2.9.4 سنتز DNA مکمل(cDNA) 60
3.2.9.5 PCR(Polymerase chain reaction) واکنش زنجیره ای پلیمراز 64
3.2.9.6 واکنش Realtime PCR 68
3.2.9.7 تجزیه و تحلیل داده های حاصل از واکنش Realtime RT-PCR 77
3.2.10 بررسی بیان eGFP-TGIF2LX در سطح پروتئین بوسیله Western blot 78
3.2.10.1 الکتروفورز عمودی SDS-PAGE 78
3.2.10.2 رنگ آمیزی SDS-PAGE 84
3.2.10.3 وسترن بلاتینگ 86
3.2.11 بررسی میزان تکثیر سلولی بوسیله تجزیه نمک تترازولیوم 90
3.2.11.1 بررسی اثر بیان افزایشی TGIF2LX سلولهای Y79 در مقایسه با کنترل 90
3.2.11.2 بررسی اثر متقابل SD-208 و بیان افزایشی TGIF2LX سلولهای Y79 در مقایسه با کنترل 91
3.2.11.3 پروتکل شمارش سلول 92
3.2.12 مطالعه بیان اثر داروی SD-208 بر روی بیانTGIF2LX, miRNA Let7g,18a,34a,22,20 در سلولهای ترانسفکت شده Y79 در مقایسه با نمونه های کنترل به وسیله Real time RT-PCR 92
فصل 4: نتایج و یافته ها 96 4.1Mini prep و هضم DNA پلاسمیدی جهت تایید وکتور نوترکیب 97
4.2 بررسی بیانTGIF2LX در سطح mRNA 98
4.2.1 نتیجه بررسی کیفی و کمی RNA 98
4.2.2 بررسی کیفی cDNA 99
4.3 بررسی بیان TGIF2LX در سلولهای ترانسفکت شده 101
4.3.1 مطالعه بیان TGIF2LX در سلولهای ترانسفکت شده Y79 در مقایسه با نمونه های کنترل بوسیله میکروسکوپ 101
4.3.2 تایید بیان واضح ژن GFP-TGIF2LX توسط Realtime RT- PCR 102
4.3.3 مطالعه بیان ژن TGIF2LX در سلول های ترانسفکت شده با وکتور حاوی GFP-TGIF2LX در سطح پروتئین بوسیله Western Blot 104
4.3.4 مطالعه بیان اثر داروی SD-208 بر روی بیانTGIF2LX در سلولهای ترانسفکت شده Y79 در مقایسه با نمونه های کنترل 105
4.4 بررسی اثر بیان افزایشی TGIF2LX بر روی سلولهای Y79 105
4.4.1 نتایج ازمایش (MTT)Microculturetetrazolium Test 105
4.4.2 بررسی اثر متقابل SD-208 و بیان افزایشی TGIF2LX بر روی سلولهای Y79 در مقایسه با کنترل 106
4.5 بررسی بیان miRNA Let7g,18a,34a.22,20a در سلولهای ترانسفکت شده و کنترل 108
4.6 مطالعه بیان اثر داروی SD-208 بر روی بیان miRNA Let7g,18a,34a.22,20 در سلولهای ترانسفکت شده Y79 در مقایسه با نمونه های کنترل 109
4.7 Ct در واکنش Realtime PCR 110
فصل 5: بحث، نتیجه گیری و پیشنهادها 113
5.1 بحث 114
5.2 تاثیر بیان افزایشی TGIF2lX بر روی Cellular Viability در رده سلولی Y79 116
5.3 تاثیر دارویSD-208 بر روی Cellular Viability در رده سلولی Y79 بیان کننده افزایشی TGIF2LX و کنترل 117
5.4 اثر SD-208 بر روی بیان TGIF2LX در رده سلولی Y79 ترانسفکت شده در مقایسه با کنترل 118
5.5 اثر متقابل SD-208 و TGIF2LX بر روی بیانmiRNA های مورد مطالعه 118
5.5.1 اثر متقابل SD-208 و TGIF2LX بر روی بیان miRNAlet7g در رده سلولی Y79 118
5.5.2 اثر متقابل SD-208 و TGIF2LX بر روی بیان miRNA18a در رده سلولی Y79 119
5.5.3 اثر متقابل SD-208 و TGIF2LX بر روی بیان miRNA34a در رده سلولی Y79 119
5.5.4 اثر متقابل SD-208 و TGIF2LX بر روی بیان miRNA22 در رده سلولی 119
5.5.5 اثر متقابل SD-208 و TGIF2LX بر روی بیان miRNA20a در رده سلولی Y79 120
5.6 نتیجه گیری 120
7.5 پیشنهاد ها ............................................................................................ ..........................121
منابع و مراجع 122
پیوست ها 131 فهرست اشكال
صفحه
شکل 1 1: چشم راست کودک دارای لوکوکوریا (چشم گربه ای) 2
شکل 1 2: مدل 2 ضربه ای رتینوبلاستوما 4
شکل 1 3: چگونگی فعال شدن گیرنده توسط TGFβ 10
شکل 1 4: چگونگی فعال یا مهار شدن مسیر TGFβ 11
شکل 1 5: مدل بیوژنز miRNA و نحوه عملکرد آن 20
شکل 3 1: شمایی از روش ترانسفکشن 50
شکل 3 2: تبدیل DEPC به اتانول و دی اکسید کربن در طی اتوکلاو 55
شکل 3 3: نمایش پیام های فلورسنت در 40 چرخه Realtime PCR 69
شکل 3 4: ساختار رنگ SG (سایبرگرین) 71
شکل 3 5: نمایش جذب رنگ SG(سایبرگرین) که منجر به افزایش پیام فلورسنت در طی واکنش PCR می شود. 71
شکل 3 6: نمایش کاربرد منحنی ذوب جهت تشخیص و تمایز محصولات اختصاصی و غیر اختصاصی واکنش PCR 73
شکل 3 7: شکل داروی SD-208 92
شکل 3 8: شمای کلی از Realtime RT-PCR جهت miRNA 93
شکل 4 1: نتیجه Mini Prep و سپس هضم انزیمی DNA پلاسمیدی استخراج شده ازباکتری حاوی وکتور پلاسمیدی نوترکیب pEGFP-TGIF2LX و pEGFP- N1.. 97
شکل 4 2: مورفولوژی سلول های سرطانی Y79با بزرگنمایی 10 توسط میکروسکوپ نوری 98
شکل 4 3: کیفیت RNA استخراج شده را نشان می دهد که بر روی آگاروز 2/1% ران شده است. 99
شکل 4 4: محصولات RT- PCR برای ژن GAPDH.برای اطمینان از کیفیت RNAاستخراج شده ازرده سلولیY79 و Y79-N و Y79-X پس از ساختcDNA با پرایمر های اختصاصی GAPDH 100
شکل 4 5: محصولاتRT- PCR برای ژن TGIF2LX بر روی آگاروز 2%. 101
شکل 4 6: مطالعه سلولهای Y79 بعد از 21 روز دوز انتخابی G418 است که توسط میکروسکوپ نوری (الف)، ) UV ب و ج) را نشان میدهند. بزرگنمایی X10 102
شکل 4 7: منحنی ذوب برای پرایمر TGIF2LX و GAPDH 102
شکل 4 8: نتایج Realtime RT-PCR 103
شکل 4 9: محصولات Realtime RT- PCR برای ژن TGIF2LX بر روی آگاروز 2%. 103
شکل 4 10: مطالعه بیان TGIF2LX در سطح پروتئین بوسیله آنتی بادی پلی کلونال بر علیه این پروتیئن 104
شکل 4 11: اثر داروی SD-208 را بر روی بیان TGIF2LX با Realtime RT-PCR 105
شکل 4 12: نتیجه MTT بیان افزایشی TGIF2LX بر روی سلولهای Y79 در مقایسه با کنترل که به صورت معنی داری درصد Cell Viabillity کاهش یافته بود. p<0.05 106
شکل 4 13: اثر داروی SD-208 بر روی رده های سلولی Y79,Y79-N. p>0.05 107
شکل 4 14: رابطه یcell viability در سلول های Y79وY79-NوY79-X درDMSO,untreate و دز 1و2 ماکرومولار SD-208 در Optimum time(48h) نشان میدهد.P<0.05 108
شکل 4 15: منحنیmelting peak مربوط به پرایمر miRNA U6,18a وNTC 108
شکل 4 16: تغییرات بیان miRNA های مورد مطالعه در این پژوهش، در سه رده سلولی Y79, Y79-N1 , Y79-TGIF2LX بوسیله Realtime RT-PCR 109
شکل 4 17: تغییرات بیانmiRNA های مورد مطالعه در این پژوهش را در Optimum dose (µM2) سه رده سلولی Y79, Y79-N1 , Y79-TGIF2LX بوسیله Realtime RT-PCR 110
فهرست جداول
صفحه
جدول 3 1: ليست کليه مواد مورد نیاز و شرکت های سازنده 33
جدول 3 2: فهرست دستگاه ها و وسایل مورد استفاده در این پژوهش 34
جدول 3 3: شرایط هضم آنزیمی 45
جدول 3 4: اجزاء واكنش سنتز cDNA 63
جدول 3 5: توالی و مشخصات پرایمر ها 67
جدول 3 6: اجزاء واكنش RT-PCR 67
جدول 3 7: برنامه زمانی و دمایی لازم جهت انجام واکنشRT-PCR 68
جدول 3 8: مواد لازم به ازای هر واکنش Realtime RT-PCR 76
جدول 3 9: برنامه ی زمانی و دمایی لازم جهت انجام واکنش Realtime RT-PCR 76
جدول 3 10: مرحله افزودن آنزیم PolyA Polymerase 94
جدول 3 11: مرحله سنتز رشته اول cDNA 94
جدول 3 12: مرحله تکثیر به روش Realtime PCR 95
جدول 3 13: دما ومدت زمان جهت Realtime PCR miRNA 95
جدول 4 1: غلظت و میزان خلوص اسید نوکلئیک های حاصل از سلول ها 99
جدول 4 2: Ct حاصل از Realtime PCR برای ژنهای GAPDH , TGIF2LX 111
جدول 4 3: Ct حاصل از Realtime PCR برای miRNAU6, Let7g, 18a, 34a, 22, 20a 112
فهرست پیوستها
صفحه
پیوست أ : نقشه پلاسمید PEGFP-N1 132
پیوست ب: نقشه پلاسمید PEGFP-TGIF2LX 133
پیوست ج: میزان تغییرات بیان ژن های مورد مطالعه در رده سلولی Y79,Y79-N به همراه standard error و p-Values در سریال دز 134
پیوست د: جداول مربوط به میزان تغییرات بیان ژن TGIF2LX در رده سلولی Y79-X,Y79-N در سریال دز به همراه standard error و p-Values 136
پیوست ه: جداول مربوط به میزان تغییرات بیان ژن miRNA Let7g در رده سلولی Y79-X,Y79-N در سریال دز به همراه standard error و p-Values 137
پیوست و: جداول مربوط به میزان تغییرات بیان ژن miRNA 18a در رده سلولی Y79-X,Y79-N در سریال دز به همراه standard error و p-Values 138
پیوست ز: جداول مربوط به میزان تغییرات بیان ژن miRNA 34a در رده سلولی Y79-X,Y79-N در سریال دز به همراه standard error و p-Values 139
پیوست ح: جداول مربوط به میزان تغییرات بیان ژن miRNA 22 در رده سلولی Y79-X,Y79-N در سریال دز به همراه standard error و p-Values 140
پیوست ط: جداول مربوط به میزان تغییرات بیان ژن miRNA 20a در رده سلولی Y79-X,Y79-N در سریال دز به همراه standard error و p-Values 141